Diseño de un formato de fragmento de anticuerpo alternativo que puede producirse en el citoplasma de Escherichia coli

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 14188 (2023) Citar este artículo

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Con una mayor accesibilidad y penetración en los tejidos, los formatos de anticuerpos más pequeños, como los fragmentos de anticuerpos (Fab) y los fragmentos variables de cadena única (scFv), muestran potencial como opciones efectivas y de bajo costo para los anticuerpos de longitud completa. Estos formatos derivados de la arquitectura modular de los anticuerpos podrían cambiar las reglas del juego para determinadas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Los huéspedes microbianos se han mostrado tremendamente prometedores como huéspedes de producción de formatos de fragmentos de anticuerpos. Sin embargo, los bajos rendimientos de proteínas objetivo, junto con la complejidad del plegamiento de proteínas, dan como resultado limitaciones en la producción. Aquí, presentamos un formato de fragmento de anticuerpo alternativo 'FabH3' diseñado para superar algunos cuellos de botella clave asociados con el plegamiento y la producción de Fabs. La molécula FabH3 se basa en el formato Fab con los dominios constantes reemplazados por dominios CH3 de inmunoglobulina G1 (IgG1) diseñados capaces de heterodimerización según el enfoque de dirección electrostática. Mostramos que este formato de fragmento de anticuerpo alternativo se puede producir eficientemente en el citoplasma de E. coli utilizando el sistema catalizado de formación de enlaces disulfuro (CyDisCo) en un estado plegado de forma nativa con rendimientos solubles más altos que su contraparte Fab y una afinidad de unión comparable contra el antígeno diana.

Entre los productos bioterapéuticos, el segmento de los anticuerpos monoclonales (MAB) ocupa una posición dominante en el mercado; sin embargo, esta tendencia parece estar cambiando gradualmente con el desarrollo de nuevos formatos de anticuerpos y nuevos medicamentos1. Los anticuerpos monoclonales de longitud completa tienen una vida media circulante prolongada, lo que podría hacerlos inadecuados para determinadas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico2. Como solución potencial, los fragmentos de anticuerpos (Fabs) se han convertido en actores clave en la industria biofarmacéutica. Ofrecen ciertas ventajas, como una penetración tumoral mejorada y profunda, unión a epítopos específicos inaccesibles a los Mab, unión a antígeno monovalente con inmunogenicidad potencialmente reducida, mayor estabilidad que los formatos de fragmentos de anticuerpos más pequeños y una eliminación más rápida3,4,5. Una multitud de aplicaciones de moléculas basadas en anticuerpos como agentes terapéuticos y de diagnóstico han intensificado su demanda y, posteriormente, la necesidad de su producción con altos rendimientos.

Muchos productos biosimilares y del tipo "yo también" aprobados se han producido en sistemas de expresión microbiana de los cuales E. coli sigue siendo una opción preferida6. Como los fragmentos de anticuerpos Fab y scFv no están glicosilados y son relativamente pequeños, su producción en E. coli puede ser más sencilla y económicamente viable que los sistemas de cultivo de células de mamíferos convencionales. Los fragmentos de anticuerpos son proteínas con enlaces disulfuro que tradicionalmente se producen de forma recombinante en el periplasma oxidante o como cuerpos de inclusión en el citoplasma reductor de E. coli. Sin embargo, ambos enfoques plantean obstáculos críticos en la producción eficiente de estas proteínas de interés. La expresión periplásmica de Fabs a menudo da como resultado bajos rendimientos de proteínas, principalmente debido a una translocación ineficiente de proteínas y al pequeño volumen del periplasma, mientras que la expresión citoplasmática enfrenta limitaciones en términos de degradación de proteínas del estado no nativo y agregación a cuerpos de inclusión. De los siete Fab comercializados, dos se producen en E. coli en forma de cuerpos de inclusión3,7. El plegamiento de Fab es un proceso complejo que implica la formación de enlaces disulfuro, la isomerización cis-trans prolil y la oligomerización controlada y, por lo tanto, el replegamiento de cuerpos de inclusión suele ser ineficiente y costoso8.

Los fragmentos Fab están compuestos por dos cadenas polipeptídicas unidas covalentemente, a saber, las cadenas pesada (HC) y ligera (LC), que contienen respectivamente dos dominios constantes CH1 y CL y dos dominios variables de unión a antígeno VH y VL (Fig. 1A). El dominio CH1 es una proteína intrínsecamente desordenada de forma aislada y permanece en un estado desplegado independientemente de la formación de enlaces disulfuro9. Uno de los pasos críticos que limitan la velocidad en el plegamiento de fragmentos de anticuerpos es la asociación de los dominios constantes, ya que el dominio CH1 adopta el pliegue típico de inmunoglobulina (Ig) solo en la interacción con el dominio CL9,10. Además, la baja estabilidad de la HC junto con la formación de dímeros de LC unidos covalentemente y no covalentemente garantiza la necesidad de equilibrar la síntesis de las dos cadenas11,12. El diseño y la selección de construcciones con diferentes intensidades de traducción de LC y HC para una expresión Fab óptima puede ser laborioso, costoso y no necesariamente tener como resultado el éxito. Ha habido varios enfoques para impulsar una heterodimerización eficiente en una molécula Fab, por ejemplo, Ojima-Kato et al. informaron la fusión de pares de péptidos de cremallera de leucina a los dominios constantes (Zipbody)13. Sin embargo, esto limita la aplicación terapéutica de Fabs debido al requisito de pasos de escisión de etiquetas y preocupaciones de inmunogenicidad posteriores.

Ilustración esquemática de (A) fragmento de anticuerpo (Fab) y (B) formato de fragmento de anticuerpo con dominios CH3 (FabH3). La inversión de la complementariedad de carga simétrica en la interfaz del dominio CH3 permite la supresión de la homodimerización debido a interacciones de carga repulsivas desfavorables, permitiendo así la formación de un heterodímero similar a Fab.

Las limitaciones asociadas con la producción eficiente de Fab plantean la necesidad de fragmentos de anticuerpos alternativos que conserven las propiedades beneficiosas de los Fab y al mismo tiempo superen sus cuellos de botella en la producción. Aquí, comunicamos un formato de fragmento de anticuerpo alternativo llamado 'FabH3' en el que los dominios constantes de una molécula Fab, a saber, REGN10987 (PDB ID: 6XDG) contra el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2, se reemplazan por IgG1. dominios constantes 3 (CH3) de cadena pesada (Fig. 1B). Esto elimina las limitaciones asociadas con el dominio CH1 en Fabs. La razón detrás del uso de dominios CH3 de IgG1 es su alta solubilidad y estabilidad junto con su notable propensión a la dimerización14,15. Como la heterodimerización es un atributo crítico de los Fabs, modificamos los dominios CH3 de IgG1 utilizando el 'diseño de intercambio de carga a carga' previamente establecido que permite una heterodimerización no covalente eficiente de los dominios CH3 y permite la supresión de la homodimerización aunque con una reducción en termoestabilidad16. Informamos que el formato FabH3 se puede producir de manera soluble con rendimientos comparativamente más altos que la molécula Fab de tipo salvaje en el citoplasma de E. coli en diferentes cepas y medios de cultivo. Además, mostramos que el formato FabH3 basado en REGN10987 producido con el sistema CyDisCo es un heterodímero plegado de forma nativa con una afinidad comparable a su contraparte Fab contra el RBD del SARS-CoV-2.

En las últimas décadas se han informado varios enfoques de ingeniería de fragmentos cristalizables (Fc) para el desarrollo de terapias basadas en proteínas biespecíficas basadas en la heterodimerización de CH317,18,19,20. Por ejemplo, Wozniak-Knopp G. et al. informaron sobre la sustitución de los dominios CH1 y CL por dominios CH3 unidos covalentemente utilizando la tecnología 'knobs-into-holes' (KiH) para una molécula de trastuzumab de longitud completa producida en células HEK293-6E21. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal de dominio intercambiado resultante mostró una baja solubilidad y una afinidad de unión cuatro veces más débil a su objetivo en comparación con el trastuzumab original. Además de la tecnología KiH para permitir la heterodimerización de CH3, el otro método ampliamente utilizado es el enfoque de polaridad de carga asimétrica. Elegimos adoptar esto para probar el formato FabH3, ya que se informa que suprime la homodimerización de manera más eficiente que los 'perillas en orificios' sin la introducción de un enlace disulfuro adicional16,22 ya que esto puede aumentar el estrés relacionado con el plegamiento oxidativo en la producción. sistema, así como aumentar la propensión al plegado incorrecto y la agregación23.

Se ha demostrado que la interfaz del dominio CH3 de IgG1 consta de residuos cargados que interactúan a través de interacciones electrostáticas favorables que rodean un núcleo hidrofóbico central16,24. Como el núcleo hidrofóbico juega un papel importante en el plegamiento y la estabilidad de las proteínas25, el enfoque de dirección electrostática implica invertir la polaridad de la carga en el borde del núcleo en la interfaz de los dominios CH3 para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización16. En la construcción FabH3 que hemos diseñado, las mutaciones K392D, K409D se introdujeron en el dominio CH3 fusionado al dominio VH y E356K, D399K se introdujeron en el dominio CH3 fusionado al dominio VL (nomenclatura basada en 16; PDB ID: IL6X). Para garantizar suficiente flexibilidad y plegamiento de los dominios variables y minimizar el impedimento estérico durante la dimerización del dominio CH3, los dominios VH y VL del Fab objetivo se fusionaron con los dominios CH3 mediante conectores flexibles compuestos de residuos de glicina y serina de longitud variable.

Como las interfaces entre los dominios VL/VH y CH3 no son nativas, existe la posibilidad de que se produzcan repulsiones estéricas o de otro tipo entre ellos. Si bien el modelado in silico basado en estructuras publicadas sugirió que un conector de tan solo cuatro aminoácidos podría funcionar, queríamos validar experimentalmente la longitud óptima del conector entre dominios. Para hacer esto, comparamos la expresión soluble de Fab REGN10987 de tipo salvaje contra construcciones FabH3 con longitudes de conector variables entre los dominios variables y los dominios CH3 de 4 a 17 aminoácidos de longitud (secuencias de aminoácidos en la Tabla complementaria S1).

Dado que todas las proteínas de interés son proteínas con enlaces disulfuro, su expresión soluble se probó en presencia de componentes CyDisCo en el citoplasma de E. coli. CyDisCo es un sistema de formación de disulfuro citoplasmático catalizado que permite la producción de proteínas recombinantes con enlaces disulfuro en E. coli26,27. La sulfhidril oxidasa Erv1p (S. cerevisiae) cataliza la oxidación de tioles en la proteína para formar disulfuros y la isomerasa PDI (H. sapiens) provoca la isomerización de disulfuros no nativos, permitiendo así que la proteína se produzca de forma recombinante en un plegado nativo. estado de enlace disulfuro en el citoplasma de E. coli28.

El análisis SDS-PAGE de proteínas purificadas basadas en cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) mostró que FabH3 se produce eficientemente en forma de heterodímero con las dos cadenas presentes en una proporción de 1:1 (Fig. 2). El formato FabH3 se produjo con rendimientos solubles comparativamente más altos que el Fab de tipo salvaje REGN10987 sin ninguna optimización adicional del proceso (Fig. 2). La longitud del conector no influyó en los rendimientos solubles del formato FabH3 ni en la relación entre las cadenas. La longitud del conector tampoco influyó en la estabilidad térmica de FabH3 (según lo determinado por fluorimetría de barrido nanodiferencial), ya que todas las variantes mostraron una temperatura de fusión (Tm) similar (Figura complementaria S1). Como la longitud del conector no influyó en la solubilidad o la estabilidad térmica del formato FabH3, todos los análisis adicionales se realizaron en el FabH3 que contenía GS-G4 como conector. Elegimos GS-G4 como longitud del enlazador, ya que los enlazadores largos pueden brindar demasiada flexibilidad estructural, lo que puede no ser óptimo para aplicaciones posteriores, y los enlazadores demasiado cortos pueden resultar en repulsiones estéricas u otras repulsiones entre dominios para las moléculas FabH3 basadas en otros Fabs.

Análisis SDS-PAGE de REGN10987 Fab y FabH3 purificados con IMAC producidos de forma soluble usando CyDisCo en el citoplasma de E. coli. Se compararon variantes de FabH3 con diferentes longitudes de conector (G: glicina, S: serina) con el Fab de tipo salvaje para determinar la influencia en los rendimientos de proteínas solubles (M: marcador de proteína). Consulte la figura complementaria S2 para ver la imagen del gel sin recortar.

Para confirmar que el aumento en los rendimientos solubles surge del diseño del formato, es decir, la eliminación de las limitaciones asociadas con el dominio CH1, y no de las condiciones de expresión, comparamos la expresión soluble basada en CyDisCo de FabH3 (enlazador GS-G4) con la contraparte Fab. entre una cepa de E. coli B y K (BL21 (DE3) y MG1655 respectivamente) en medios ricos en autoinducción. Nuestros resultados demuestran que, si bien los rendimientos solubles del formato FabH3 son comparables entre las dos cepas de E. coli analizadas, son aproximadamente el doble que los de la contraparte Fab en ambas cepas (Tabla 1). También examinamos la producción soluble basada en CyDisCo de FabH3 y Fab en E. coli BL21 (DE3) en medios de autoinducción mínimos químicamente definidos. El Fab REGN10987 de tipo salvaje no se pudo producir de forma soluble mientras que el formato FabH3 se produjo en forma soluble, aunque con rendimientos comparativamente más bajos en comparación con los medios ricos (Tabla 1). Estos hallazgos sugieren que los mayores rendimientos solubles observados para el formato FabH3 son el resultado de que el diseño del formato supera potencialmente las limitaciones de plegado y producción del formato Fab, independientemente de las condiciones de expresión.

La producción de proteínas terapéuticas con enlaces disulfuro en el citoplasma de huéspedes microbianos como E. coli suele ser un desafío debido a sus limitadas capacidades de modificación postraduccional, que a menudo conducen a la degradación y agregación de proteínas29. Aunque el empleo del sistema CyDisCo en el citoplasma de E. coli permitió la producción de REGN10987 Fab y FabH3 en forma soluble, este último con rendimientos comparativamente más altos, desarrollar un formato de anticuerpo donde la cantidad se une a la calidad es de suma importancia. Evaluamos el estado de plegamiento de los formatos de anticuerpos producidos utilizando un conjunto de herramientas de caracterización analítica ortogonal antes de su caracterización funcional.

La estructura secundaria de REGN10987 Fab y FabH3 purificados (enlazador GS-G4) se examinó utilizando dicroísmo circular (CD). Como ambas proteínas de interés están compuestas de dominios que poseen el pliegue característico de inmunoglobulina (Ig), se esperaba que los espectros de CD de estas proteínas exhibieran formas típicas de proteínas con un alto contenido de estructura β30. El análisis de CD indicó que ambas proteínas exhibieron espectros de CD ultravioleta lejano (UV) con un mínimo de alrededor de 217 nm, lo que es consistente con tener un pliegue de Ig característico (Fig. 3A, B). Las diferencias en los espectros se pueden explicar porque se ha demostrado que los espectros de diferentes moléculas Fab difieren en términos de amplitud, forma e intercepción de la línea base en función de los cromóforos de la cadena lateral aromática y/o del enlace disulfuro31,32,33.

Espectros de dicroísmo circular (CD) ultravioleta lejano de proteínas purificadas (A) REGN10987 Fab (B) FabH3 basado en REGN10987. Ambas proteínas muestran espectros consistentes con su estructura esperada rica en β de dominios de inmunoglobulina, es decir, veces Ig.

Un análisis adicional mediante espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS) de REGN10987 Fab y FabH3 purificados confirmó que las proteínas tenían los pesos moleculares esperados (Tabla 2) consistentes con tener todas las cisteínas en enlaces disulfuro. Para evaluar más a fondo la presencia de cisteínas libres, las proteínas se trataron con N-etil maleimida (NEM) en condiciones desnaturalizantes antes del análisis espectrométrico de masas. No se observó ningún aumento en la masa correspondiente a la unión a NEM (+ 125 Da) para las proteínas de interés, confirmando así la ausencia de tioles libres (Tabla 2). Una combinación de datos de CD y ESI-MS sugiere que las proteínas producidas con CyDisCo en el citoplasma de E. coli están plegadas de forma nativa.

El comportamiento de la solución de REGN10987-Fab y FabH3 purificados se analizó utilizando SEC-MALS para determinar la presencia de dímeros nativos, así como la ausencia de degradantes y especies oligoméricas de alto peso molecular. La determinación del peso molecular de las dos proteínas en condiciones no desnaturalizantes confirmó la presencia de ambas en un estado dimérico con puntos de masa molar uniformes calculados a lo largo del pico de elución con una precisión del 2% o menos, lo que indica especies monodispersas (Figura complementaria S4A). Los resultados obtenidos también demuestran la ausencia de fragmentos monoméricos o agregados oligoméricos (Figura complementaria S4B).

Se sabe ampliamente que el dominio CH3 de IgG1 de tipo salvaje es un dominio de inmunoglobulina altamente termoestable34,35. Sin embargo, la heterodimerización es esencial para un análogo de Fab funcional y previamente se ha demostrado que la introducción de mutaciones en el dominio CH3 para permitir la heterodimerización en anticuerpos monoclonales biespecíficos produce una reducción en la estabilidad térmica16,17,21,24. Examinamos la estabilidad térmica del formato FabH3 producido en el citoplasma de E. coli utilizando nanofluorimetría de barrido diferencial (NanoDSF) y se encontró que estaba de acuerdo con lo informado anteriormente para la molécula de proteína de fusión biespecífica scFv-Fc basada en dirección electrostática producida. en un sistema de expresión de mamíferos16. Se observó un despliegue cooperativo para el formato FabH3 en contraste con el plegado no cooperativo observado para su contraparte Fab (Fig. 4) de acuerdo con las características de despliegue previamente informadas de λ-Lc que contiene Fabs36. El despliegue bifásico de Fab implica la pérdida de la actividad de unión al antígeno antes de la ruptura de la estructura secundaria37. Como se observa en las curvas de despliegue térmico, el inicio del despliegue del Fab REGN10987 ocurre comparativamente mucho antes que la temperatura de fusión (Fig. 4). Aunque se descubrió que el formato FabH3 posee una Tm final comparativamente más baja que el Fab, todavía se encuentra dentro de un rango que permite la producción de proteínas terapéuticas viables, ya que la estabilidad térmica está de acuerdo con la tecnología patentada de Amgen para la generación de anticuerpos biespecíficos mediante dirección electrostática16. 38.

Análisis de estabilidad térmica de REGN10987 Fab y FabH3 basado en REGN10987 utilizando NanoDSF. Se encontró que los puntos de inicio para REGN10987 Fab y FabH3 fueron 50,0 °C y 42,5 °C respectivamente, mientras que los valores finales de Tm fueron 75,1 °C y 59,9 °C respectivamente.

Uno de los atributos de calidad críticos que se investigarán al desarrollar un formato de anticuerpo alternativo es la interacción de la molécula propuesta contra el antígeno objetivo. La capacidad de unión de un anticuerpo es función de las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) ubicadas en los dominios variables que a su vez depende de la estabilidad y asociación de las interfaces del dominio39.

Anteriormente hemos demostrado que el Fab REGN10987 de tipo salvaje producido utilizando el sistema CyDisCo es funcional y se une al antígeno diana SARS-CoV-2 RBD40. Después de asegurarnos de que el FabH3 basado en REGN10987 producido en el citoplasma de E. coli estuviera plegado de forma nativa, investigamos empíricamente si la molécula desarrollada era funcionalmente activa y comparamos su afinidad de unión con la del Fab REGN10987 mediante interferometría de biocapa (BLI). La afinidad de unión entre Fab o FabH3 contra el antígeno diana se evaluó basándose en la relación de las constantes de velocidad de disociación (kd) y asociación (ka), es decir, en función de la constante de disociación de equilibrio (KD). Se probaron en paralelo cinco concentraciones de Fab y FabH3 para determinar su unión al RBD del SARS-CoV-2 y los valores de KD se determinaron mediante un análisis de ajuste global basado en un modelo de interacción 1:1.

Tanto Fab como FabH3 mostraron unión al antígeno diana de una manera dependiente de la concentración (Fig. 5A, B). Se descubrió que FabH3 exhibía una afinidad de unión comparable (KD = 20 ± 2,6 nM) a su contraparte REGN10987 Fab (KD = 43 ± 4,4 nM) contra el RBD del SARS-CoV-2. Los valores de KD observados para el REGN10987 Fab están de acuerdo con informes anteriores40,41, validando así nuestro hallazgo. Estos resultados sugieren que la sustitución de dominios constantes en una molécula Fab y la heterodimerización basada en dominios CH3 no interfiere con el plegamiento y la función de los dominios variables de modo que se mantengan las interacciones con su antígeno.

Análisis basado en interferometría de biocapa (BLI) de la interacción de unión entre (A) REGN10987 Fab, (B) FabH3 basado en REGN10987 y el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2. Ambos formatos de anticuerpos probados muestran una unión dependiente de la concentración al antígeno diana (gris: 3 nM, rojo: 9 nM, azul: 27 nM, verde: 81 nM, morado: 243 nM). La curva de análisis en estado estacionario para la interacción anticuerpo-antígeno en función de la concentración de proteína se muestra en la figura complementaria S3.

Los avances en biología sintética que conducen a la ingeniería celular de huéspedes microbianos han dado como resultado una mayor aceptación de estas fábricas de células como alternativa para producir terapias basadas en anticuerpos42. Si bien los anticuerpos monoclonales han dominado las estrategias de tratamiento contra enfermedades potencialmente mortales, los avances en la ingeniería de anticuerpos han dado lugar a una variedad de alrededor de 100 formatos de anticuerpos diferentes (consulte43,44,45 para obtener revisiones exhaustivas sobre formatos y aplicaciones de anticuerpos biespecíficos). No hay consenso sobre "un formato ideal" que sea adecuado para la mayoría de las aplicaciones deseadas, sino que el desarrollo de nuevos formatos ofrece una fuente valiosa para superar los obstáculos terapéuticos y de producción de los formatos actuales.

Los fragmentos de anticuerpos Fab son una de las primeras moléculas de anticuerpos pequeñas estudiadas y han demostrado un papel importante en intervenciones diagnósticas y terapéuticas46. Con la creciente demanda y el potencial futuro de los Fabs o sus proteínas de fusión, existe una necesidad constante de que la "capacidad de desarrollo" de este formato se produzca de manera eficiente. Aprovechando los avances realizados en el desarrollo de biespecíficos, el formato FabH3 que presentamos aquí tiene el potencial de superar ciertas limitaciones críticas de la producción de Fab en E. coli. La estrategia de heterodimerización del dominio CH3 de IgG1 previamente probada utilizada aquí permite la producción de moléculas heterodiméricas, evitando así las limitaciones de homodimerización de cadenas ligeras en moléculas Fab de tipo salvaje11,47. Se sabe que las limitaciones asociadas con la baja estabilidad intrínseca y la tendencia a la degradación del dominio CH1 en Fabs dan como resultado una producción de Fabs de bajo rendimiento en E. coli3,10,48. Estos cuellos de botella se pueden superar con la fuerte propensión a la dimerización, la alta solubilidad y la estabilidad de los dominios CH3 de IgG1 utilizados en el formato FabH3 propuesto. Esta suposición está validada por los niveles de producción soluble más altos del formato FabH3 que los de su contraparte Fab correspondiente. Además, el formato FabH3 es biológicamente activo y muestra una afinidad de unión comparable al formato Fab contra el antígeno diana. Aunque se ha informado que el dominio CH3 de IgG1 de tipo salvaje exhibe heterogeneidad redox cuando se produce usando CyDisCo en el citoplasma de E. coli14, la supresión de la homodimerización potencialmente ralentiza la velocidad de plegamiento, lo que permite la formación de enlaces disulfuro y, por lo tanto, el plegamiento nativo. Este no es el primer informe que utiliza homodímeros o heterodímeros de CH3 de IgG como andamios para la producción de formatos de anticuerpos, por ejemplo, scDb-CH3 (KiH), Di-Diabody, Minibody, etc.49,50,51. Sin embargo, hasta donde sabemos, este es el primer informe de un formato Fab alternativo basado en la heterodimerización del dominio CH3, uno que puede producirse de manera más eficiente utilizando el sistema CyDisCo en el citoplasma de E. coli.

Según la "prueba de concepto" que se presenta aquí, este diseño de formato puede ser una solución potencial para las fábricas que enfrentan cuellos de botella en la producción. Sin embargo, la aplicabilidad general de este formato debe idearse empíricamente, ya que depende de las interacciones de la interfaz entre los dominios variable y CH3, y de la solubilidad de los socios del dominio variable. El trabajo potencial futuro puede implicar la ingeniería del formato FabH3 para mejorar la estabilidad térmica basándose en las variantes del heterodímero ZW previamente informadas52. Además, también se puede emprender la ingeniería de proteínas para ampliar la aplicabilidad del formato FabH3 basado en proteínas de fusión Fab para una gran variedad de aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico53,54. Se ha demostrado que las mutaciones en el dominio CH3 de IgG1 promueven la interacción del receptor Fcγ en ausencia de glicosilación55. Al poder producirse en un huésped microbiano, estas mutaciones pueden potencialmente aplicarse al formato FabH3 para aumentar la vida media y provocar funciones efectoras para ciertas aplicaciones terapéuticas56.

Todos los vectores de expresión informados aquí se construyeron utilizando técnicas estándar de biología molecular (consulte la Tabla complementaria S2 para ver los vectores utilizados en este estudio). Se sintetizó un gen policistrónico para el Fab de tipo salvaje REGN10987 con codones optimizados (GenScript Biotech Corp.) para la expresión de E. coli. El gen para la cadena pesada con una etiqueta de hexahistidina C-terminal se colocó aguas abajo del gen para la cadena ligera y se clonó usando digestión y ligadura de restricción basada en Xba1-EcoR1 en un vector basado en pET23 modificado con el promotor T7 reemplazado por un promotor pTac. para generar el vector pAAT5026,40. Se sintetizaron genes para las cadenas pesada y ligera de variantes de FabH3 basadas en REGN10987 con diferentes longitudes de conector con codones optimizados (GenScript Biotech Corp.) para la expresión de E. coli. Estos genes se clonaron en el mismo vector principal utilizando digestión y ligadura de restricción basada en Nde1-EcoR1. Para generar un vector policistrónico con una ubicación de genes similar a la del Fab de tipo salvaje, el gen para el dominio VH fusionado a un dominio CH3 de IgG1 (K392D, K409D) con una etiqueta de hexahistidina C-terminal se colocó aguas abajo del gen para VL. dominio fusionado a un dominio CH3 de IgG1 (E356K, D399K). El gen para la cadena pesada de FabH3 se clonó en el vector que contiene la cadena ligera de FabH3 usando digestión y ligación de restricción basada en Xba1/Spe1-Xho1 para generar los vectores pAAT202-pAAT207. Los vectores plasmídicos purificados se obtuvieron utilizando el EZNA Plasmid DNA Mini Kit I (Omega Bio-Tek Inc.) y la purificación del ADN a partir de geles de agarosa se realizó utilizando el kit de extracción de fragmentos de ADN Gene/PCR (GeneAid Biotech), ambos de acuerdo con las directrices de los fabricantes. . Todos los insertos de genes en los vectores construidos se secuenciaron completamente antes de las pruebas de expresión para evitar errores en los genes clonados.

Las pruebas iniciales empleadas para detectar las variantes de FabH3 con múltiples longitudes de conector y comparar los rendimientos de expresión soluble se realizaron en placas de 24 pocillos profundos (DWP). El plásmido policistrónico que contiene los genes de interés y el plásmido policistrónico que contiene los componentes CyDisCo Erv1p y PDI (pMJS205)26 se usaron para cotransformar E. coli BL21 (DE3) químicamente competente y se incubaron durante la noche a 37 °C en agar caldo de lisogenia (LB). placas que contienen los antibióticos apropiados (cloranfenicol 35 µg/mL para derivados de pLysS y ampicilina 100 µg/mL para derivados de pET23). Las colonias transformadas obtenidas después del crecimiento durante la noche se usaron para inocular 2 ml de medio LB suplementado con 4 g/l de glucosa y antibióticos adecuados por pocillo en un 24-DWP cubierto con membranas AirOTop (Thomson) permeables al oxígeno. Estos cultivos iniciadores se dejaron crecer a 30 °C, 250 rpm (radio de giro de 2,5 cm) durante aproximadamente 6 a 8 h. Los cultivos de expresión que contenían 3 ml de medio de autoinducción de caldo fantástico esterilizado en autoclave (Formedium), suplementados con 0,8% de glicerol y antibióticos adecuados por pocillo, se sembraron con los cultivos iniciadores en una proporción de 1:100. Los cultivos de expresión se cultivaron a 30 ° C, 250 rpm en placas de 24 pocillos profundos cubiertas con membranas AirOTop (Thomson) permeables al oxígeno para garantizar una oxigenación eficiente durante aproximadamente 23 a 24 h. La fracción soluble del lisado celular se usó para realizar las etapas de purificación adicional y análisis SDS-PAGE para determinar y comparar los rendimientos de expresión de proteínas solubles.

Para la cuantificación y comparación del rendimiento, se usaron pAAT50 o pAAT203 junto con pMJS205 para cotransformar células E. coli BL21(DE3) o MG1655 químicamente competentes y se cultivaron en placas de agar LB con antibióticos apropiados. Los cultivos de expresión que contenían 20 ml de medio de autoinducción de caldo fantástico esterilizado en autoclave (Formedium) suplementados con 0,8% de glicerol, o medios de autoinducción mínimos químicamente definidos preparados de acuerdo con 57, se sembraron con cultivos iniciadores en una proporción de 1:100. Los cultivos de expresión se cubrieron con membranas AirOTop (Thomson) permeables al oxígeno y se cultivaron en matraces agitados de 250 ml a 30 °C, 250 rpm durante 23 a 24 h para medios ricos y ~ 40 h para medios químicamente definidos. Los valores finales de densidad óptica de los cultivos se midieron a 600 nm y se encontraron en el rango de 24,0–26,5 y 18,5–20,0 para E. coli BL21 (DE3) y MG1655 respectivamente en medios ricos, y 15,0–17,0 para E. coli BL21 (DE3) en medios químicamente definidos. Los rendimientos de proteínas se calcularon a partir de fracciones purificadas con IMAC de los lisados ​​solubles por triplicado mediante análisis de densitometría utilizando REGN10987-Fab o FabH3 purificados como estándares de concentración. El análisis densitométrico para determinar los rendimientos de proteínas objetivo se llevó a cabo utilizando el software ImageJ.

Al finalizar la selección de expresión a pequeña escala, las células E. coli BL21 (DE3) se transformaron con los vectores para Fab de tipo salvaje REGN10987 (pAAT50) o FabH3 con un conector GS-G4 (pAAT203) junto con el vector para los componentes CyDisCo ( pMJS205) se cultivaron en matraces de 1 L que contenían 100 ml del fantástico medio de autoinducción de caldo (Formedium). Estos matraces de cultivo se cubrieron con filtros de membrana AirOTop (Thomson) permeables al oxígeno para garantizar una oxigenación eficiente y se incubaron a 30 °C, 250 rpm durante 23– 24h.

Los cultivos a pequeña escala en 24 DWP o matraces agitados se recogieron mediante centrifugación a 6500 x ga 4 °C y los sedimentos celulares se resuspendieron en 3 ml o 20 ml de tampón de lisis respectivamente (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, 20 μg/ mL DNasa, 0,1 mg/mL de lisozima de clara de huevo), se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y se congelaron a - 20 °C. Las células se lisaron mediante congelación y descongelación y, como las proteínas de interés contienen una etiqueta de hexahistidina, se purificaron con cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) estándar utilizando resina HisPur Cobalt Superflow Agarose (Thermo Scientific) en condiciones nativas después de la eliminación del lisado celular mediante centrifugación (4000 rpm, 20 min, 4 °C). El protocolo seguido para la purificación basada en Cobalto-IMAC se ha descrito en14.

Para los cultivos a gran escala en matraces de 1 L, se recogieron las células y la fracción soluble del lisado se procesó para su purificación como se describe en 40. REGN10987 Fab de tipo salvaje y FabH3 (enlazador GS-G4) se purificaron utilizando una combinación de dos pasos de cromatografía: cromatografía de afinidad por metales inmovilizados a base de níquel (IMAC) y cromatografía de intercambio aniónico (AnEx). El protocolo detallado para ambos pasos de cromatografía se describe en 40. La proteína purificada obtenida después de la etapa AnEx se intercambió con tampón por fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5 para REGN10987 Fab y pH 6,0 para FabH3. Se congelaron instantáneamente alícuotas de las fracciones de proteína purificadas con nitrógeno líquido y se almacenaron a -20 °C hasta su posterior análisis. El método de producción y purificación del dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 marcado con DsbC truncado mutado (mtDsbC) se ha descrito en detalle en 40.

Los espectros de dicroísmo circular (CD) ultravioleta lejano de las proteínas purificadas se midieron utilizando un espectrofotómetro Chirascan-Plus. Los escaneos se realizaron por duplicado como un promedio de 3 escaneos a 22 °C usando una cubeta con una longitud de trayectoria de 0,1 cm, un ancho de banda espectral y un tamaño de paso de 1 nm, y una velocidad de escaneo de 1 nm/s. Para la medición se utilizó un rango de longitud de onda de 195 a 250 nm y para los escaneos se garantizó un valor de voltaje de alta tensión (HT) inferior a 800 V. La concentración final de la muestra de proteína purificada (en fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0/6,5) utilizada para el análisis fue de 0,1 mg/ml diluida en agua ultrapura. El espectro final se obtuvo como promedio de los escaneos y se restó el blanco.

La estabilidad térmica de las proteínas fue evaluada por NanoDSF utilizando el sistema Prometheus NT.48 (NanoTemper Technologies, Alemania) por triplicado. Las proteínas purificadas de interés se intercambiaron con tampón en fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4 utilizando un filtro centrífugo microcon-10 kDa (Merck, EE. UU.) y se cargaron en capilares estándar (10 µl) de grado NanoDSF. Luego, estas muestras cargadas se sometieron a un aumento térmico programado (1 °C/minuto) de 20 °C a 90 °C. Se utilizó un detector UV dual para medir la señal de fluorescencia resultante de la desnaturalización térmica de la proteína a 330 nm y 350 nm. La primera derivada de la relación entre las dos señales se usó para determinar el/los punto/s de inflexión y la temperatura de fusión (Tm) se calculó usando el software PR.ThermControl (NanoTemper Technologies).

Las pruebas SEC-MALS se realizaron en un sistema HPLC Shimadzu con un detector UV en línea, un detector RI (Optilab, Wyatt Technology) y un detector MALS (miniDAWN, Wyatt Technology). La separación de proteínas purificadas (1,5 mg/ml) se llevó a cabo en una columna Superdex™ 200 Incremento 10/300 GL (Cytiva) a un caudal de 0,5 ml/min usando fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0, filtrado con membrana de 0,1 μm como fase móvil. El procesamiento y análisis de los datos se realizó utilizando el software ASTRA v. 7.3.2.19 (Wyatt Technology).

El análisis del peso molecular de las proteínas purificadas se realizó mediante espectrometría de masas de ionización por electropulverización en combinación con cromatografía líquida (LC-ESI-MS) utilizando un espectrómetro de masas Q-Exactive Plus (Waters, MA, EE. UU.). Primero se sometieron 0,5 mg/ml de la proteína purificada de interés a desnaturalización usando clorhidrato de guanidina 5 M. Después de la desnaturalización, las muestras atrapadas con NEM se trataron con NEM 10 mM, se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego la reacción de alquilación se inactivó con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,5% antes del análisis. Para las muestras atrapadas sin NEM, se añadió directamente TFA al 0,5% a las muestras de proteínas desnaturalizadas antes del análisis. El peso molecular experimental (Mexp) de la proteína se obtuvo mediante análisis de espectrometría de masas y el peso molecular teórico (Mtheor) se calculó utilizando la herramienta ExPasy ProtParam58 en función de la secuencia de aminoácidos de las proteínas.

Antes del análisis de interacción in vitro, el antígeno purificado mtDsbC-SARS-CoV-2 de tipo salvaje se sometió a biotinilación utilizando el protocolo descrito en 40. La interacción in vitro del antígeno biotinilado con REGN10987 Fab y FabH3 de tipo salvaje se analizó utilizando un instrumento Octet RED384 (ForteBio, EE. UU.). Los ensayos se realizaron con agitación continua a 1000 rpm, 30 °C. Todas las mediciones se realizaron utilizando tampón cinético de tampón fosfato salino (PBS) 1X (ForteBio) en placas de 96 pocillos. Después de obtener una línea de base inicial con el tampón de ejecución, se inmovilizaron 5 µg/ml del antígeno biotinilado en los biosensores Streptavidin (SA) Dip and Read™ (ForteBio) durante 600 s. Se analizaron cinco concentraciones diferentes de cada uno de REGN10987 Fab y FabH3 purificados para determinar su unión al antígeno. El análisis de datos se realizó en el software Octet Data Analysis High Throughput (HT) 11.0.

Los datos presentados en este estudio están contenidos en el artículo y el material complementario. Los conjuntos de datos están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue financiado por el Programa Personas (Acciones Marie Skłodowska-Curie) del Programa Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención REA no. 813979 (SECRETARIOS). Se agradece el uso de las instalaciones centrales de Biocenter Oulu, miembro de Biocenter Finland. Un agradecimiento especial al Dr. Ulrich Bergmann y al Dr. Hongmin Tu por su ayuda con el análisis de espectrometría de masas y interferometría de biocapa, respectivamente.

Unidad de Investigación de Biología Estructural y Proteínas, Facultad de Bioquímica y Medicina Molecular, Universidad de Oulu, 90220, Oulu, Finlandia

Aatir A. Tungekar y Lloyd W. Ruddock

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Investigación y análisis experimental AAT, Supervisión: LWR, Conceptualización LWR, Redacción y edición del manuscrito: AAT, Revisión y edición del manuscrito: LWR, Financiamiento: LWR Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito.

Correspondencia a Lloyd W. Ruddock.

La Universidad de Oulu posee una patente para el sistema CyDisCo: Método para producir proteínas plegadas de forma nativa en un huésped procariótico (número de patente 9238817; fecha de la patente 19 de enero de 2016). Inventor: Lloyd W. Ruddock. El otro autor no declara ningún interés en conflicto.

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Tungekar, AA, Ruddock, LW Diseño de un formato de fragmento de anticuerpo alternativo que puede producirse en el citoplasma de Escherichia coli. Representante científico 13, 14188 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41525-3

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Recibido: 23 de mayo de 2023

Aceptado: 28 de agosto de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41525-3

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